——记中国科学技术大学生命科学学院吴清发教授    
本刊记者 徐 赛

    
　　 在大众眼里，遗传密码可以从一个生命体传到另外一个生命体，生命的密码就蕴藏其中。在基因王国里浸润了近20年的吴清发，不知疲倦，就是因为这里充满了无穷的魅力。    
　　 2014年12月12日，国际著名病原学期刊《科学公共图书馆-病原》（PLOS Pathogens）在线发表了中国科学技术大学吴清发教授研究团队与中国农业科学院植物保护研究所李世访研究员研究团队合作的研究成果——在苹果锈果病样品中发现一种新的具有核酶活性的环状RNA的最新成果。这一突破性发现引起了业界学者专家和各大媒体的高度关注，而吴清发教授和他近年一直从事的基因组学和生物信息学研究，也从幕后走到了台前。    

探寻环状RNA的真面目    

　　 一直以来，被称作苹果锈果病的严重病害困扰着果农。一旦苹果树被感染后，果实就会出现锈果、开裂或花斑等症状，影响果实质量。上世纪80年代，在研究苹果锈果病时，中国农业科学院兴城果树研究所的果树病毒专家刘福昌研究员和日本果树病毒专家小金泽硕城均从苹果中分离到一种关键遗传物质——特殊环状RNA。但是，限于检测及分析技术的限制，一直未能揭示出它的真面目。    
　　 植物病毒和类病毒在植物体内复制时，会形成双链RNA的特殊核酸分子，这种核酸分子可被植物细胞内的防御蛋白Dicer识别，产生长度为21-24碱基的siRNA。应用最新测序技术对植物的所有的小RNA测序，然后对测序数据进行生物信息学分析，可以获得植物病原体的信息。在传统的研究中，科学家所依赖的生物信息学工具主要是序列同源比对方法，对获得的数据进行分类和功能预测，鉴定出与已知病原体遗传物质具有一定同源性的新病原体序列，但对和已知序列没有同源性的序列进行分类和功能预测仍然是目前生物信息学研究的难点。    
　　 植物类病毒的遗传物质是特殊的RNA分子，在感染植物细胞中后可产生大量的相互重叠的来源该RNA分子的siRNA。吴清发研究组从2010年开始开发生物信息学鉴定发现新类病毒的PFOR算法，这种算法不依赖于已知类病毒遗传物质的同源性，而是基于环状RNA的结构特征而开发的非同源依赖的类病毒鉴定方法，因此可识别全新的类病毒。该工作于2012年发表在的美国科学院院刊（PNAS）上，在行业内部引起了广泛的关注。    
　　 2012年，在一次国际会议中，吴清发教授结识了长期从事类病毒研究的李世访研究员，并决定共同探究苹果中环状RNA的真面目。在与李世访团队合作研究的过程中，他们又对PFOR的算法进行了优化和改进，获得了具有并行处理能力的快速运算程序PFOR2，其运行速度比PFOR提高了3?8倍，从而能够处理高通量测序获得的大量数据。该程序可用于小RNA和RNA-seq数据分析，这为他们后来的研究创造了高效独到的研究手段。依托于此，合作研究团队采用了高通量测序（NGS）技术结合生物信息学分析的策略, 通过对含有环状RNA的苹果锈果样品进行分析，经过几个月的摸索和反复验证，他们终于拿到了该环状RNA的全序列。    
　　 序列分析发现，该环状RNA由434个核苷酸组成，是一种迄今为止从未公布的新的环状RNA，其具有鳄梨日斑类病毒科的典型结构元件——核酶结构域并验证了其自切能力。自我国报道后，美国、意大利等国研究人员的检测结果也为此提供了有力的佐证。有意思的是，生化实验表明，该环状RNA正、负链均具有核酶活性，能够进行自我剪切。该研究为进一步破解和防治相关果树疾病奠定了重要基础，也为今后从植物和动物中发现更多环状RNA提供了新的思路和技术手段。而更为重要的是，PFOR2这种新型运算方法，可以利用RNA-seq数据来鉴定环状RNA分子能力，这也将会极大促进植物类病毒的发现，对研究类病毒的起源和进化机制奠定了良好的基础。    

融入生命科学研究的新浪潮    

　　 从各种科学发展的普遍规律看，任何一轮实验数据和观测数据的大积累，都会引起一场新技术和新学科的革命。因而，世界各国科学家对基因组序列测定这场生命科学的新技术革命都报以极大的期望。    
　　 有着分子生物学、微生物等多学科背景的吴清发选择了基因生物信息这块新兴的交叉领域。近10年来，该领域的研究依托了计算机系统收集、储存、分析和比较各种基因组信息，服务于生物学数据研究，发展迅速。    
　　 1999年，当时还在中国科学院遗传与发育生物学研究所人类基因组研究中心（中国科学院北京基因组所前身）攻读博士学位的吴清发就对这一研究产生了浓厚的兴趣。专业基础扎实的他作为技术骨干，参与“人类基因组计划中国部分”的序列解析和数据分析工作。他在其中担任小组负责人，带领小组成员完成了“人类基因组计划中国区域”的BAC物理图谱的构建、基因组序列的组装、基因组序列的功能注释和论文写作等相关工作，这些经历和成果为他博士毕业交上了一份完美的答卷。    
　　 有了参与人类基因组的实践经验，他又作为技术负责人之一，参与了超级杂交水稻基因组计划，家蚕基因组计划等重大物种的基因图谱的绘制工作。并且这期间，他又作为交流博士生，在丹麦哥本哈根大学医学院功能基因组中心从事人类疾病基因的定位克隆工作。学无止境，2004年4月开始，他去到美国继续深造，先后在美国西北大学、美国加州大学河滨分校进行博士后研究和工作，在人造血干细胞转录谱、病毒和宿主相互作用等研究方向做出了系列工作并取得优秀的成绩。    
　　 正如上世纪50年代微电子技术的发明和应用带来了第三次技术革命一样，科学手段的革新也颠覆并加速了领域研究的方法和进程。2001年，美、英、法、德、日、中六国合作，历时十年，耗资数十亿美元的人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）宣告完成。各国科学家以此为契机，为解读基因的密码继续不懈努力，而这其中最大的突破之一，就是第二代测序技术的推出。吴清发亲身感知生命科学领域的发展并为之振奋，因为HGP的顺利完成向科学家们证明了，人类有能力对自身的遗传信息进行研究。吴清发教授从中看到了生命科学研究的希望，也找到了自己研究的方向。    
　　 在随后的10年里，他利用第二代测序仪器海量数据的生产能力，进行了人造血干细胞CD34+的转录组绘制、病毒—宿主相互作用机制研究等课题的研究，有了一系列成果和发现。    
　　 ——传染性非典型肺炎病原基因组序列解析和临床检测试剂盒的研制。作为主要工作人员，吴清发参与完成了四株与SARS密切相关的冠状病毒基因组解码工作，这是中国最早解析的SARS基因组序列。随后，他带领团队研制了高灵敏度的RT-PCR检测试剂盒，并应用该试剂盒筛选1000多份临床样本，为北京市控制SARS的流行做出了贡献，吴清发也因此作为团队成员获得了2004年北京市科学技术进步奖二等奖。    
　　 ——人造血干细胞CD34+的转录图谱绘制工作。团队克服样本来源稀少的挑战，通过高通量测序方法，获得了10000多条EST的表达序列。这套数据是当时最为完整的CD34+造血干细胞的转录图谱，对该领域的基础生物学和医学研究有重要的参考意义。    
　　 ——建立一种新的研究细胞内polyA-的方法。吴清发发展了一套独特的方法来分离富集细胞内不带有poly A尾巴的RNA分子，并应用第二代测序仪对分离富集的序列进行高通量测序并进行生物信息学分析，他首次表明Hela细胞内三分之二的RNA不带有poly A尾巴。    
　　 ——发现了RNA沉默在果蝇体内抗病毒机制和病毒的反作用机制。吴清发和其队友一起发现FHV病毒的siRNA集中于病毒基因组的5'端，是来源于病毒复制的中间产物；病毒通过编码抑制蛋白结合病毒合成的双链RNA，从而抑制病毒小RNA的产生。吴清发团队还第一次在果蝇细胞内发现病毒源性的piRNA。    
　　 ——建立了新的系统鉴定病毒的生物信息学方法。团队通过对宿主细胞的小RNA进行高通量的测序，然后应用生物信息学方法对测出的序列进行组装分析，鉴定宿主所携带的未知病毒，研究成果发表于PNAS上。该方法能应用于发现新虫媒传染病的病源，在媒介害虫防治中具有重要意义。    

十年沉淀，厚积薄发    

　　 新世纪的头10年，我国经济取得了巨大发展，生命科学领域正拉开精彩的序幕。2010年10月，吴清发博士选择了回国，在中国科学技术大学生命科学学院开启了属于他的第二个十年科研之旅。    
　　 自2010年筹建中国科学技术大学生命学院基因组与生物信息学实验室以来，吴清发教授带领团队在中科院、科技部、国家自然科学基金等一系列课题、项目的攻关路上，一路耕耘，一路收获。    
　　 战略性先导科技专项是中国科学院在中国至2050年科技发展路线图战略研究基础上，瞄准事关我国全局和长远发展的重大科技问题提出的集科技攻关、队伍和平台建设于一体力求能形成重大创新突破和集群优势。作物病虫害的导向性防控项目是2014年立项的先导项目，该项目以昆虫—病原微生物相互关系作为研究模式，通过系统解析生物间信息流产生、识别、传递及自然操纵的分子生物学基础，以期阐明生物间信息交流的新现象与新机制。在该项目的引导下，吴清发教授带领课题组成员致力于揭开植物病毒的基因奥秘。吴清发教授说，病毒和类病毒是植物重要的病原体，感染植物后使植物正常的生长和发育遭到破坏，严重影响农作物的产量和品质，因此对植物病毒和类病毒的鉴定分类是植物病毒病防治的基础和前提。由于80%植物病毒对植物的侵染依赖介体昆虫如蚜虫、粉虱、飞虱等昆虫的传播，研究昆虫与病毒互作是揭示昆虫传播病毒机制的基础。    
　　 在研究生物基因的科学家看来，在植物和昆虫体内，RNA沉默是一种保守的抗病毒机制，它主要通过宿主的核酸内切酶Dicer识别病毒来源的双链RNA，产生病毒siRNA并被组装入蛋白中，形成有活性的沉默复合体RISC，进而切割、降解病毒的基因组RNA或mRNA, 从而抑制病毒在宿主细胞内复制并清除病毒。    
　　 因此，吴清发教授利用生物信息学、分子生物学、病毒学和基因组学等手段开展研究。经过长期的研究，他们建立了全新概念的非同源依赖鉴定类病毒的PFOR方法并应用该方法鉴定了多种植物的新类病毒；建立通过组装小RNA发现新病毒的vdSAR方法并应用该方法发现多个新病毒；建立了昆虫与FHV病毒的互作模型、发现了昆虫piRNA通路抗病毒作用。与此同时，他以中国科大实验室的名义，发表了SCI论文9篇, 影响因子合计大于60。在这期间，吴清发教授还参加多项国内外会议并应邀发言。    
　　 除了去年年底的发现，吴清发团队从2011年开始收集国内许多植物的病变样本，应用vdSAR方法鉴定发现了多个新病毒，其中包括可能引起槟榔黄化病的长线形病毒、患病水稻中分离获得的新病毒。    
　　 在病毒—昆虫、病毒—植物互作机制研究中，他们借助模式生物的优势，研究果蝇的抗病毒机制，为研究介体昆虫与病毒互作机制提供了借鉴意义。随着研究的深入，他们将南方黑条矮缩病毒与白背飞虱免疫互作的机制，特别是其RNA沉默抗病毒机制作为研究重点，并取得突破性进展。目前，白背飞虱基因组已被吴清发团队成功破解，有很多重要的科学发现、相关的基因组分析论文正在准备当中。    
　　 与生物基因打交道的十多年，吴清发教授追寻着生物遗传的印记，享受发现的乐趣。第二个十年又过去了一半，在生命科学的这条道路上，他的步履愈加踏实，因为还有和他并肩作战的团队和由此展开的精彩人生。