——记昆明理工大学灵长类转化医学研究院教授李天晴

本刊记者  刘玉杰

 

1990年，诺贝尔生理学或医学奖授予给了美国医生J.E.默里和E.D.托马斯，因为他们在医学史上的重大贡献——发明一种治疗疾病的新方法，即细胞和器官移植。

毋庸置疑，器官和细胞移植是20世纪生物医学工程领域中具有划时代意义的技术。它是人类改变传统药物治疗方式，使衰竭器官恢复功能的一种新医疗模式，为医学领域带来了革命性变化。2013年，世界卫生组织调研显示，全球一年实施了近12万例器官移植手术。尽管无数病患因此获得了新生，但令人忧心的是，这一数据仍只能满足不到10%移植等待者的需求。并且，对于器官移植和捐献领域起步较晚的我国而言，器官需求数量与供给数量的比例更加触目惊心。

不过，科学家正在探寻新的方法，有可能在不久的将来，这一现状就将得到革命性的变化。

除了公民自愿捐赠器官外，需要器官移植的病患或许又多了一种新选择——选取自身的一点皮肤细胞，通过干细胞再造器官技术挽救自己的生命。为了这一梦想，昆明理工大学灵长类转化医学研究院教授李天晴，多年来不断开拓创新、勇攀高峰，带领团队开展的灵长类多功能干细胞全能性研究取得了重大进展，为无数重病患者带来了生的希望。

 

梦之源起——

瞄准多功能干细胞研究

 

干细胞即为起源细胞，是一类具有增殖和分化潜能的细胞，具有自我更新复制的能力，在一定条件下能够产生高度分化的功能细胞，医学界称之为“万用细胞”。人类对干细胞的研究被认为开始于20世纪60年代。在几个近亲种系的小鼠睾丸畸胎瘤的研究中，表明其来源于胚胎生殖细胞。此工作确立了胚胎癌细胞是一种干细胞。

1998年，美国威斯康星大学教授詹姆斯·汤姆森利用人的胚胎建立了世界第一株人类胚胎干细胞系。而正是由于人胚胎干细胞系的建立才产生了再生医学的概念，使干细胞研究显示其巨大的应用价值，受到人们的广泛关注。

21世纪初，当新千年的钟声敲响，还在中国科学院昆明动物研究所读博士的李天晴，开始跟随导师展开了灵长类干细胞的研究之旅。在意识到干细胞研究领域的无限发展前景后，2005年，博士毕业的李天晴就顺理成章地留在了所里当了助理研究员。然而，随着研究的日益深入，他也渐渐感觉到知识和研究手段的缺乏。为此，在2006年10月，李天晴毅然前往美国进行干细胞的博士后研究。并于2011年年底归国，投入了干细胞与再生医学的海洋。

一直以来，将人类胚胎干细胞投入医学应用的障碍之一，正是在于它们极其具有前景的一个特征——天生能够快速分化为各种类型的细胞。直到现在，科学家们仍然无法回答的一个重大科学问题是：灵长类（包括人）干细胞是否具有原始态的特性，即能嵌合到早期胚胎并产生嵌合体。这已经成为制约干细胞临床应用的关键性科学问题之一。

然而，人多能干细胞(PSCs)与大、小鼠相比，表现出不同的特性以及调控机制。实验表明，小鼠的胚胎干细胞容易在体外保持它们的原始态、未触发状态，而人类胚胎干细胞则很难在体外保持这种状态。根据发育阶段、克隆形态、信号依赖、线粒体代谢、嵌合能力、基因表达以及表观遗传等差异，哺乳动物干细胞多能性被分为原始态(Naive)和始发态(Primed)两种状态。Naive多能干细胞具有更好的体内分化发育能力，相似于囊胚前的早期胚胎卵裂球。当其注射到早期胚胎后，能够参与胚胎的发育和分化，产生嵌合体动物，再生功能的组织器官，而Primed多能干细胞这样的功能相当有限。

同大小鼠相比，人的胚胎干细胞研究存在的最大问题就是没有一个统一的标准来衡量干细胞的多能性。传统的体外分化和畸胎瘤等方法，只能对干细胞的分化能力进行定性分析，不能回答所有与人类多能性相关的问题，诸如人类多能性细胞是否具有正常的体内发育能力、这些已分化的细胞被移植后是否仍保持原来的细胞命运、这些细胞是不是会无控地增殖和迁移等。

由于缺乏统一的评价标准，导致不同实验室建立的人ESC（胚胎干细胞）、iPSC（诱导多功能干细胞）差异很大，在基因表达以及分化倾向性方面存在较大差异，阻碍了干细胞的临床应用。而由于小鼠ESCs具有Naive（原始态）特性，因此不同ESCs系之间的基因与分化能力差异较少，预示了获得Naive PSCs是干细胞实现临床转化的关键条件之一。

然而，目前仅小鼠和大鼠上具有这种Naive PSCs。如何建立人的Naive PSCs以及干细胞的鉴定标准，仍是干细胞基础研究和临床应用需要解决的一个重大科学问题。这也是李天晴一直以来奋斗的目标。

由于伦理和条件的限制，无法直接在人类干细胞检测其多能性。猕猴或食蟹猴作为与人类亲缘关系很近的非人灵长类，在解剖、生理、遗传，特别是在神经系统结构与功能上如认知、情绪、和社会行为等方面，表现出与人类的高度相似性。因此，猴被认为是多种人类神经系统类疾病唯一或最合适的实验动物模型。更为重要的是，猕猴或食蟹猴与人类的PSCs极为类似，而与啮齿类动物的PSCs差异巨大。利用灵长类疾病动物模型，建立干细胞治疗疾病的技术标准和规范，促进干细胞在体内的安全性和有效性，将实现干细胞的临床转化。

金属王国”之美誉的云南，拥有丰富的灵长类资源。1965年，距今约170万年的元谋人被发现于云南元谋县上那蚌村西北小山岗上。这是迄今为止发现的亚洲最早人类。

2014年，在多年的灵长类研究基础上，昆明理工大学灵长类转化医学研究院成立。成立之初，便以建成国际一流的灵长类转化医学研究院为目标，通过产学研结合，促进以非人灵长类动物作为技术平台的生物医学技术研究及其产业化应用。通过多学科交流与融合，结合中心自身的优势条件，目前，研究院已开辟了干细胞与再生医学等多个不同的研究发展方向，拥有干细胞培养、分离、分化以及鉴定等所需的各种大型仪器和实验条件。其依托下的云南中科灵长类生物医学重点实验室，下设灵长类生殖与发育生物学实验室、灵长类干细胞与再生医学实验室、灵长类神经生物学实验室、病理实验室、灵长类动物实验和质量控制实验室以及中心实验室等，拥有丰富的灵长类资源的得天独厚的地域和技术储备优势，依托灵长类等实验动物养殖和动物实验研究体系，开展灵长类生物医学和人类重大疾病的灵长类动物模型相关的基础和应用基础研究。

正是得益于云南省丰富的灵长类资源及世界一流的人类重大疾病灵长类动物模型研究技术和平台，从2002年起，李天晴就在灵长类干细胞的科研之路上不断攀登，并取得了多项重大突破：首先在国际上建立了猴子胚胎干细胞的同源饲养层培养以及猕猴胚胎干细胞定向分化为功能神经干细胞的体系；同时，通过长期的探索研究，他们还创造了干细胞领域里程碑式的成果——首次在世界上分离了原始态的灵长类干细胞，并证明这些细胞能够产生嵌合体猴。这是第一次在世界上证明，高等动物的干细胞可以产生嵌合体动物。

 

梦之基石——

“嵌合体猴”的诞生

 

在古希腊神话中，有一只脾气十分暴虐的怪兽奇美拉（Chimera）。它长着狮子的头，蛇的尾巴，背上还有一个会喷火的羊脑袋……这便是世界上最早出现的嵌合体动物。

简单来讲，所谓嵌合体就是指由不同基因型的细胞所构成的生物体。而嵌合体动物，就是将一个动物的胚胎干细胞注射到另一个动物的囊胚当中，随后通过辅助生殖技术而获得的产物。1907年，德国植物学家和遗传学家H.温克勒把嵌合体比喻为希腊神话中狮首、羊身、蛇尾的奇美拉神兽，这也是嵌合体外文名Chimera的由来。

随着技术的发展，目前，科研人员已经通过胚胎干细胞嵌合成功的嵌合体动物只有小鼠和大鼠。嵌合体的形成是评价干细胞Naive特性的金标准。然而，灵长类多能干细胞是否能够产生灵长类嵌合体，一直是个世界性难题。2012年，美国Oregon国家灵长类中心的Shoukhrat等人在Cell杂志上发表文章表明，培养的猴PSCs不具有嵌合体产生的能力。

那么，灵长类多能干细胞究竟能否产生嵌合体动物呢？

尽管一次次试验、一次次失败，李天晴团队依旧坚持不懈。面对外界不断传出的否定理论，他和研究队伍不为所动，一心沉浸在自己的实验世界中。最后通过改良的培养条件，他们改变了食蟹猴胚胎干细胞（cESCs）的生长特性、基因表达谱和维持自我更新的信号通路，将cESCs转化为Naive-like cESCs（由于不清楚这些细胞能否在四倍体补偿的条件下产生干细胞猴，因此李天晴团队把他们称为Naive-like细胞）。当这些细胞注入桑椹胚后，形成嵌合体囊胚。之后，李天晴团队又将15个嵌合体囊胚移植到5只母猴体内，有2只成功怀孕。3个多月后，为了检测各种组织器官的嵌合情况，他们对两只胎儿终止了怀孕过程，检测到两只胎儿成功实现了嵌合，而这两只采用的是同一种干细胞处理技术。

随后，研究人员检测了3月龄猴子的心脏、肾脏、胰脏、大脑、脾脏、肺、肝脏、睾丸、皮肤等18个器官，都检测到了经过标记后的干细胞。这样，就证明了嵌合进去的干细胞整合到了胚胎中，参与了机体各种器官的发育并分化成各种组织细胞。

2015年7月2日，李天晴团队的这一成果成功发表在国际一流期刊Cell Stem Cell杂志上。论文一经发表后便引起了巨大关注。李天晴团队的研究，首次在世界上证明了利用灵长类ESCs获得嵌合体猴是可行的，同时也证明了灵长类动物胚胎干细胞的全能型，具有重大的科学和应用价值：1、为建立灵长类（包括人）PSCs的鉴定标准提供了重要参考；2、实现对体内组织器官的再生，为最终体内再生功能器官用于病人器官移植提供重要的研究基础；3、结合基因定向修饰技术，建立人类特定疾病的非人灵长类动物模型。

在器官移植领域，早在一百多年前，国内外一些科研人员就开始研究异种器官移植。1905年，法国进行了世界第一例异种器官移植手术，把兔肾脏植入肾功能衰竭儿童体内，手术很成功，但16天后由于排异反应，这名儿童死于肺部感染。

为了减少异种移植中的排异反应，科研人员尝试敲除供体的某些基因，取得了一些研究进展，但还没有完全突破。

而嵌合体猴的研究，则希望用另一种方式解决排异反应。将灵长类动物中的食蟹猴作为研究对象，利用它的胚胎干细胞成功获得嵌合体猴。理论上，通过此胚胎干细胞生长出来的各项组织器官与原来的食蟹猴应当是一致的，将嵌合体猴的器官移植到原来的食蟹猴中，就很好地解决了异种移植带来的排斥反应。

如果研究不断获得进展，在大量再生器官的安全性和功能性评价基础上，未来还可以用病人自身的皮肤细胞，经过重新编程后成为全能干细胞，然后将全能干细胞注射到猪或其他动物的胚胎中去再生出病人自身的器官，最终为挽救病人的生命做出贡献。

一分耕耘一分收获。李天晴团队坚持不懈的努力也为他们带来了丰厚的回报。2016年2月，该研究成果被评为云南省2015年的十大科技成果；李天晴本人也因此被中国干细胞生物学分会授予“干细胞青年研究员奖”。同时，以色列威兹曼科学院的国际著名多能干细胞研究专家Jacob H. Hanna也对他们的工作进行了高度评价，认为具有里程碑意义。

 

梦之锻造——

在奋斗中前行

 

产生“嵌合体猴”究竟意味着什么？撇开这项技术在国际干细胞领域产生的极大影响，对于李天晴而言，“目前，这个工作仅仅是宏伟目标的一小步，意味着还有很多工作要做”。

作为新的医学革命，以干细胞治疗为核心的再生医学，已成为继药物治疗、手术治疗后的另一种疾病治疗途径。然而，大多数类型的干细胞，缺乏对干细胞治疗的安全性和有效性方面的科学评估。因此，利用与人高度相似灵长类疾病动物模型，建立干细胞治疗神经疾病的技术标准和规范，促进干细胞在体内的安全性和有效性，即促进干细胞临床转化，是李天晴的另外一个梦想。然而，干细胞临床前研究需要解决以下几个重大的问题：1）干细胞的规模化培养，满足临床的大量需求；2）将PSCs定向分化为高纯度特定的、安全的功能细胞；3）促进功能细胞在体内的存活和功能的重建。

为了解答这些问题，李天晴团队又展开了一系列研究计划。

首先是实现了多能干细胞的可规模化培养。干细胞的规模化培养是干细胞领域的一个比较关键性的技术，传统的采用二维的培养方法无法满足临床和药物筛选的大量需求。为此，李天晴团队设计了一套简单的三维悬浮培养体系，通过细胞筛，将人和猴子的多能干细胞切割成大小均质的团块，通过悬浮培养为均质的细胞球，并通过细胞筛切割进行连续传代。采用这种简单的方法，团队实现了人和猴PSCs的长期传代，并保持干细胞的多能性。5天内干细胞可以实现19倍的扩增，其增值速度是二维培养体系下的2?2.5倍。该培养体系不仅简单，而且容易进行规模化培养，目前已经获得国家专利的批准。

并且，在神经干细胞、特定神经细胞培养以及分化等方面，李天晴团队也建立了一系列成熟的系统：建立了单个神经上皮干细胞的扩增系统和神经疾病与发育的研究系统，可以促进对神经管发育的理解，并进而开发为治疗神经系统的细胞产品；首次证明人多能干细胞高效分化为功能的、可移植的人大脑皮层投射神经元，该体系为干细胞治疗脑损伤以及为研究CfuPNs（皮层投射神经元）和中间神经元发育的典型细胞模型。

为了实现个性化医疗和精准治疗，避免移植后的免疫排斥反应，传统的方法是将病人的体细胞重编程为iPSCs细胞，然后再分化为特定的细胞，但由于iPSCs的低效率以及安全性问题，阻碍了其临床转化。为此，李天晴团队开发了灵长类成纤维细胞直接转分化为功能端脑神经上皮干细胞的体系，通过体系的改进将猴子成纤维体细胞直接转化为iNESCs（神经上皮干细胞），为干细胞的个性化医疗和精准治疗提供了重要的研究基础。

同时，他们还建立了3D条件下可规模化诱导人和猴多能干细胞定向分化为心肌细胞。干细胞治疗需要大量的细胞，如心肌梗死等需要大约1x109的细胞数量。同样，采用二维的分化体系，很难获得足够的心肌细胞。为了解决这个问题，李天晴团队设计了一个三维的培养体系。该体系是在三维培养多能干细胞的基础上进行的，整个培养体系非常简单、无生长因子，全部采用小分子物质进行。并且，由该体系培养出来的心肌球具有正常心肌细胞的超微结构、钙波、成熟基因的表达谱和对药物的反应，可以作为一个药物的筛选平台。进一步研究发现，三维条件下产生的心肌细胞比二维条件下产生的心肌细胞具有更好的成熟功能。而该系统则非常适合规模化生产心肌细胞用于疾病的研究、细胞的治疗和药物的筛选。目前为止，相关的培养体系以及培养基已经申请国际专利，获得了PCT授权，并进入了美国和中国的专利申请阶段。

而在细胞治疗和神经细胞再生方面，李天晴团队也取得了多项突破，发现了成年动物的视网膜里存在干细胞，这些干细胞通过体外纯化后，在体外能无限扩增，并分化为七种不同的视网膜细胞。在合适的分化条件下，视网膜干细胞能够分化为高纯度的感光细胞，移植到rd1突变的视网膜色素炎和rd7突变的夜盲症的疾病动物的视网膜后能够整合到视网膜，分化为视网膜感光细胞，并与体内的双极细胞建立功能链接，恢复对光的感应能力，具有重大的临床转化价值。

此外，神经干细胞在小鼠脑内能够很好整合，但在灵长类动物脑内的整合仍然是一个难题。通过长期的攻关探索，李天晴团队成功地建立了神经上皮干细胞（NESCs），为了探索移植治疗，将NESCs在移植前分别进行了几种不同方法的分化，并分别将这些分化的细胞移植到成年猕猴的大脑皮层以及纹状体部位。结果表明，不同分化条件下的细胞都能整合到大脑中，并分化为成熟神经元。但它们之间的整合能力存在显著性差异。研究还发现，细胞的整合能力与细胞移植的位置具有重要的关系，如相比大脑皮层，NESCs更容易整合到纹状体；而皮层的白质区域不利于细胞的存活。这些平台和工作的建立，不仅多是原创性的工作，更为重要的是，这些NESCs移植到猴子的脑部后，能够整合、迁移并分化为神经元和星型胶质细胞，并表达特异的神经递质，为下一步干细胞治疗奠定了重要的基础。

 

梦之起航——

从胰腺移植开始

 

2016年4月，世界卫生组织发布报告称，全球糖尿病患者人数已经从1980年的1.08亿增加到2014年的4.22亿，而且世界上有8.5%的成年人均患有糖尿病。同时，由于我国人口基数大，人口老龄化加剧以及饮食结构等因素，导致我国糖尿病患者人数约1.1亿人，位居世界第一。

糖尿病是由于胰腺细胞的胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。近年来，随着患病人数的激增，需要通过胰腺移植治疗糖尿病及其并发术的病人也与日俱增。目前，在各种器官移植中，胰腺移植已经成为仅次于肾、肝脏与心脏以外，占第4位的器官移植。然而，目前我国每年约有150万人因末期器官功能衰竭需要进行器官移植，但最终只有1万人完成了器官移植手术。如果采用传统的器官捐献方法，根本无法获得足够的胰腺器官数量。

为此，李天晴团队以前期工作为基础，目前又开展了“利用灵长类多能干细胞体内再生胰腺器官”项目研究，以期通过对干细胞体内再生胰岛组织器官关键性技术的突破，建立灵长类动物的体内再生组织器官的技术平台，为最终再生人类器官提供重要的研究基础。

Pdx1基因是胰腺早期发育的一个关键基因，其缺失将导致胰腺发育的缺陷。2010年，日本东京大学T.Kobayashi等人将小鼠的多能干细胞注射到Pdx1－/－基因（即缺失Pdx1基因）的小鼠胚胎，发现出生小鼠的胰腺来自注射的Naive多能干细胞，并且将大鼠Naive多能干细胞移植到Pdx1－/－基因小鼠的早期胚胎，在小鼠体内能够再生大鼠的胰腺，实现了多能干细胞在同种动物间以及异种动物间胰腺器官的体内再生。其后，日本学者Kato Seiji Usui等人采用该方法将小鼠Naive多能干细胞注射到Sall1－/－的小鼠胚胎（肾脏发育缺陷的胚胎），发现多能干细胞再生了小鼠的肾脏，实现了多能干细胞体内再生肾脏器官。这些突破性的研究结果表明Naive多能干细胞具有再生体内组织器官的能力，而组织器官的再生关键在于是否存在具有良好嵌合能力的多能干细胞。

以往的研究表明，当灵长类干细胞被注射到猴子早期胚胎后，发现细胞并不能有效地嵌合到猴的胚胎中，产生嵌合体猴，因此不具有器官再生的能力。

好在，这些技术瓶颈问题在前期的研究基础中已经被李天晴团队有效克服了。

2015年，李天晴团队在世界上首次分离的能够产生嵌合体猴的Naive猴子多能干细胞，在嵌合到猴子胚胎里后能伴随胚胎在体内的发育，分化为机体内的各种组织细胞。其中，胰腺在所有的组织器官中，表现了较高的嵌合率。重要的是，Naive干细胞在胰腺分化为外分泌腺细胞和胰岛细胞，其中分化的胰岛细胞包括β细胞、α细胞以及胰岛前体细胞。该技术的突破，为体内构建灵长类的组织器官奠定了重要的技术基础。

同时，李天晴团队所在的云南中科灵长类生物医学重点实验室，还于2013年利用目前世界最新的基因组编辑技术CRISPR/Cas9和TALENs，实现了猕猴和食蟹猴两个物种的靶向基因修饰，首次在世界上建立了基因敲除的猴模型。

因此，在“利用灵长类多能干细胞体内再生胰腺器官”项目中，李天晴团队选择了胰腺组织作为研究的突破口，结合目前已经建立的灵长类动物基因敲除猴技术，通过TALEN等技术，敲除受体猴的胰岛器官发育的关键性基因Pdx1，阻止胚胎细胞发育为胰腺器官，然后将具有嵌合能力的Naive猴多能干细胞注射到Pdx1－/－基因的猴胚胎里面，利用干细胞在体内对胰腺发育的补偿作用，实现胰腺组织器官体内的再生；在此基础上，通过优化细胞的注射时间、注射的细胞数量以及注射后胚胎的体外培养等方式，研究影响胰腺器官再生的一些因素。

作为检验灵长类多能性干细胞的最佳模型，“利用灵长类多能干细胞体内再生胰腺器官”项目对猕猴和食蟹猴的研究结果将为筛选出能够具有Naive的人多能性干细胞，提供重要的研究基础，进而为人类器官的体内获得提供可能。

“科学家的天职叫我们应当继续奋斗，彻底揭露自然界的奥秘，掌握这些奥秘便能在将来造福人类。”对于科研的目的，居里夫人曾如是说道。而这也同样是李天晴团队的终极目标。